Litik bakteriyofajların izolasyonu karakterizasyonu ve çoklu ilaç dirençli pseudomonas aeruginosa'ya karşı çeşitli antimikrobiyal ajanlarla sinerjik etkileşiminin in vitro araştırılması

Abstract

Çoklu ilaç dirençli Pseudomonas aeruginosa, artan tedavi zorlukları nedeniyle kritik bir halk sağlığı sorunudur. Bu çalışmada, Balıkesir bölgesindeki atık sulardan izole edilen iki litik bakteriyofaj (BAUNPA1 ve BAUNPA3), farklı antibiyotikler [kolistin (COL), siprofloksasin (CIP), meropenem (MEM), tobramisin (TOB)] ve antimikrobiyal peptitler [murepavadin (MUR), peksiganan (PEX)] ile kombinasyon halinde in vitro olarak değerlendirilmiştir. Fajlar morfolojik (TEM) ve genetik (RFLP) analizlerle karakterize edilmiştir. Her iki fajın biyolojik özellikleri değerlendirilmiş 30 dk lık latent dönem, optimum MOI değeri 10, pH 6–8 aralığında ve 50 °C’ye kadar stabilite ile birlikte, BAUNPA1 için yaklaşık 189 ve BAUNPA3 için yaklaşık 43 gibi patlama boyutu değerleri saptanmıştır. Konak aralığı analizinde BAUNPA1 %34, BAUNPA3 %60 oranında lizis göstermiştir. Klinik örneklerden soyutlanan elli P. aeruginosa izolatına karşı, kolistin ve murepavadin, en düşük MİK50/MİK90 (0.5/1 μg/mL) değerleriyle en etkili ajanlar olmuştur. Faj-antimikrobiyal madde kombinasyonları, seçilmiş beş klinik izolat üzerinde modifiye çift tabakalı agar (disk difüzyon, alt agar ve yumuşak agara sub-MİK antibiyotik/peptid eklenmesi) ve dama tahtası yöntemleriyle, eşzamanlı ve ardışık uygulama modelleriyle test edilmiştir. Disk difüzyon yöntemi, plak boyutunda sınırlı bir artış sağlarken; alt veya yumuşak agara sub-MİK antibiyotik/peptid eklenmesiyle plak sayısı ve boyutunda anlamlı artışlar gözlemlenmiştir. Alt agara sub-MİK antibiyotik/peptid eklenmesi plak boyutunu artırmada daha etkili olurken; yumuşak agara sub-MİK antibiyotik/peptid eklenmesi ise plak sayısında daha fazla artışa neden olmuştur. Plak boyutunda en belirgin artış MEM ile sağlanırken, plak sayısında artışa neden olan antibiyotikler MEM, COL ve CIP olmuştur. Dama tahtası yönteminde eşzamanlı uygulamalarda CIP, COL ve MEM ile genellikle sinerjik etkileşim gözlenirken, ardışık modelde (faj-önce) antibiyotiklerin yanı sıra MUR ve PEX ile de sinerjik etkileşim gözlenmiştir (FİKİ ≤ 0.5). Bu tez, litik fajların klinik kullanımdaki antibiyotikler ve antimikrobiyal peptitlerle kombinasyonlarının farklı in vitro modellerde karşılaştırmalı analizini sunarak, dirençli P. aeruginosa enfeksiyonlarında yeni tedavi stratejileri geliştirilmesine katkı sağlamaktadır.Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is a critical public health concern due to increasing treatment challenges. In this study, two lytic bacteriophages (BAUNPA1 and BAUNPA3) isolated from wastewater in the Balıkesir region were evaluated in vitro in combination with various antibiotics [colistin (COL), ciprofloxacin (CIP), meropenem (MEM), tobramycin (TOB)] and antimicrobial peptides [murepavadin (MUR), pexiganan (PEX)]. The phages were characterized morphologically (TEM) and genetically (RFLP). Biological properties of both phages were assessed, revealing a 30-minute latent period, an optimal MOI value of 10, stability between pH 6–8 and up to 50 °C, and burst sizes of approximately 189 for BAUNPA1 and 43 for BAUNPA3. In host range analysis, BAUNPA1 and BAUNPA3 showed lysis rates of 34% and 60%, respectively. Among fifty P. aeruginosa isolates obtained from clinical samples, COL and MUR were the most effective agents with the lowest MIC₅₀/MIC₉₀ values (0.5/1 μg/mL). Phage–antimicrobial agent combinations were tested on five selected clinical isolates using modified double-layer agar methods (disk diffusion, incorporation of sub-MIC antibiotic/peptide into bottom or soft agar) and checkerboard assays under simultaneous and sequential application models. The disk diffusion method yielded limited increases in plaque size, whereas the addition of sub-MIC antibiotics/peptides to the bottom or soft agar led to significant increases in both plaque number and size. Incorporation into bottom agar was more effective in increasing plaque size, while incorporation into soft agar caused greater increases in plaque number. The most notable increase in plaque size was observed with MEM, while MEM, COL, and CIP contributed to increased plaque numbers. In checkerboard assays, simultaneous application generally resulted in synergistic interactions with CIP, COL, and MEM, whereas in the sequential model (phage first), synergistic effects were also observed with MUR and PEX (FICI ≤ 0.5). This thesis presents a comparative analysis of lytic phage combinations with clinically used antibiotics and antimicrobial peptides across different in vitro models, contributing to the development of novel therapeutic strategies against resistant P. aeruginosa infections.