Prostat Kanserinde KLK-4'ün Transkripsiyonel Regülasyonu

Abstract

15 üyeden oluşan İnsan kallikrein ile ilgili peptidaz (KLK) ailesinin bazı üyelerinin prostat kanseri ve diğer kanserler ile olan ilgisi gösterilmiştir. KLK'ler, serin proteazların kimotripsin (S1) ailesine aittir. Ailenin birkaç üyesi potansiyel kanser biyolojik belirteçleri olarak bildirilmiştir. KLK proteinlerinden kanser biyobelirteçi olarak kulanılan en yaygını, prostata spesifik antijen (PSA- ayrıca KLK3 olarak da bilinir) dir. PSA ve diğer KLK'lar arasındaki yapısal benzerlik göz önüne alındığında, ailenin kalan üyelerinin kanser biyobelirteçleri olarak potansiyel rolü son yıllarda çokça araştırılmıştır. Prostat kanserinde KLK4'ün aşırı ekspresyonunun kemik metastazı veya ileri evre arasında korelasyon olduğu da bildirilmiştir. Doku oksijenizasyonunun normal değerin altına düşmesi hipoksiya olarak tanımlanır. Tümör hücreleri oksijeni yeterli miktarda alamadığında hücre ölümüne gitmeden çeşitli genetik farklılıklar meydana getirerek hipoksik koşula adapte olmaktadır. Pek çok klinik araştırmalar tümörün hipoksik olduğunu ve hipoksiyanın yükselmesiyle tümör çapının arttığını göstermektedir. Bu kapsamda hücrelerin mikro çevresinin hipoksik durumu da düşünüldüğünde, KLK-4?ün hipoksiya ile regülasyonun aydınlatılması gerekliliği açıktır. Çalışmamız kapsamında Prostat hücre hattı modeli olan PC-3 ve LNCap hücrelerinde hipoksik koşullarda KLK-4 gen ifadesi mRNA, protein ve promotor aktivitesinin ölçülmesi ile transkripsiyonel düzeyde değerlendirilmiştir. Çalışmamızda kimyasal hipoksi modeli oluşturulmuştur ve modelin doğrulanması mRNA seviyesinde Real-Time PCR ile, protein seviyesinde ise western blot ve IFC yöntemi ile yapılmıştır. MTT testi ile CoCl2 ve TGF-ß? nın PC-3 ve LNCaP hücrelerinde çalışılan zaman dilimlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir sitoksik etkisi gözlenmemiştir. KLK-4 promotor parçalarını içeren vektör klonlama çalışmaları yapılmıştır. Tüm promotor parçalarının bazal aktiviteleri karşılaştırıldığında en yüksek bazal aktivite P2 (760 bç) promotor parçasında tespit edilmiştir. P1 (1104bç), P2 (760bç) ve P3 (391bç) promotor parçalarının hipoksik koşullarda özellikle 48 saatte aktivitelerinin arttığı tespit edilmiştir. P4 (102 bç) promotor parçasının hipoksik aktivitesi değerlendirildiğinde normoksik şartlara kıyasla aktivitesinde herhangi bir artış gözlenmemiştir. TGF-ß uygulamasının hücreler üzerindeki uyarıcı etkisi SMAD2/3 mRNA seviyelerindeki artış ile koreledir. PC-3 hücre hattında TGF-ß ve hipoksik gruplarda KLK-4 mRNA seviyesi 1 ve 3 saatlerde artarken, 6 ve 24 saatlerde TGF-ß uygulamasının mRNA seviyesindeki ekspresyonunda azalmaya, hipoksik koşullarda ise yine diğer saatlerde olduğu gibi artışa sebep olmuştur. LN-CAP hücre hattında TGF-ß ve hipoksik gruplarda KLK-4 mRNA ekspresyonunda 72 saatte artış tespit edilmiştir. KLK-4? ün TGF-ß etkili regülasyonunun özellikle hipoksik şartlar altında up regüle olduğu bunun da SMAD yolağı ile etkileşimi protein seviyesinde belirlenmiştir. Ayrıca ek olarak farklı inhibitör deneyleri ile TGF cevabının SMAD bağımlı yoldan gerçekleştiği tespit edilmiştir. Olası SMAD ve HIF-1 transkripsiyon faktörelerinin bağlanma bölgeleri temel alınarak tasarlanan EMSA primerleri tasarlanmıştır. Bu amaçla bir SMAD bölgesi için (-496/-465) ve iki tane Hif1 bölgesi için (-122/-92 ve -740/-710) EMSA primeri tasarlanmıştır ve bu bölgelerin bağlanma bölgesi olduğu EMSA İLE tespit edilmiştir. Bu çalışma kapsamında ilk kez Prostat kanseri hücre hattı olan PC-3 ve LNCaP hücrelerinde normal ve hipoksik koşullarda TGF-ß sitokini ve HIF transkripsiyon faktörünün KLK-4 geninin regülasyonuna katkısı incelenmiştir. Çalışmamız kapsamında TGF-ß ve hipoksinin KLK-4 ifadesini regüle ettiği tespit edilmiştir. Bu etki hipoksik koşullarda oldukça güçlü bulunmuştur. Sonuç olarak elde ettiğimiz veriler literatüre KLK-4?ün prostat kanserindeki regülasyonu hakkında yeni bilgiler sunmuştur.