Lipopolisakkarit ile indüklenen deneysel akut karaciğer hasarında MFG-E8/laktadherin uygulamasının ferroptotik biyobelirteçler üzerine etkisinin araştırılması

Abstract

Sepsis, enfeksiyona karşı düzensiz konak yanıtı sonucunda gelişen, yaşamı tehdit eden bir organ disfonksiyonu olup karaciğer sepsisten sık etkilenen ve prognozu belirleyen organlardan biridir. Demire bağımlı, lipit peroksidasyonuyla karakterize kontrollü bir hücre ölüm biçimi olan ferroptozun sepsise bağlı organ hasarında rol oynadığı düşünülmektedir. Apoptotik hücrelerin temizlenmesinde görev alan ve antiinflamatuar özellikleri bulunan süt yağı globülü epidermal büyüme faktörü-8 (MFGE8) ise bu süreçte olası koruyucu bir molekül olarak öne çıkmaktadır. Bu çalışmada, lipopolisakkarit (LPS) ile oluşturulan deneysel sepsis modelinde MFG-E8 uygulamasının karaciğer hasarı, inflamasyon ve ferroptoz ile ilişkili biyobelirteçler üzerindeki etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada otuz altı yetişkin erkek Wistar albino sıçan; kontrol (n=8), LPS (n=10), LPS+MFG-E8 (n=10) ve MFG-E8 (n=8) olmak üzere dört gruba ayrıldı. Sepsis, tek doz 2 mg/kg LPS (E. coli, O111:B4)’nin intraperitoneal enjeksiyonuyla oluşturuldu. MFG-E8 LPS’den bir saat sonra intraperitoneal 20 µg/kg olarak uygulandı. Altıncı saatte alınan serum ve karaciğer örneklerinde histopatolojik hasar (mononükleer hücre infiltrasyonu, konjesyon, vakuolleşme) hematoksilen-eozin boyaması ile, hepatik demir depoları Prusya mavisi boyaması ile, serum AST ve ALT düzeyleri otoanalizör ile, doku TNF-α ve IL-1β düzeyleri ELISA yöntemi ile, ferroptozla ilişkili olarak doku Fe²⁺, MDA, total GSH ve GSSH düzeyleri kolorimetrik yöntem ile ve GPX4 ve ACSL4 proteinleri düzeyleri Western Blot ile değerlendirildi. LPS grubunda kontrole kıyasla mononükleer hücre infiltrasyonu ve konjesyon, serum AST ve ALT düzeyleri, doku TNF-α ve IL-1β düzeyleri ile hepatik demir birikimi ve demir düzeyleri anlamlı olarak yüksek bulundu. LPS sonrası MFG-E8 uygulaması, sadece hepatik demir birikimini LPS grubuna göre anlamlı şekilde azalttı. Buna karşın karaciğer fonksiyon testlerinde, inflamatuar sitokinlerde ve diğer ferroptoz belirteçleri üzerinde olumlu bir eğilim görülmesine rağmen istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bu bulgular, LPS ile indüklenen sepsis modelinde altıncı saatte belirgin akut karaciğer hasarı, inflamatuar yanıt ve hepatik demir birikiminin geliştiğini; MFG E8’in koruyucu etkisinin ise erken dönemde öncelikle demir metabolizması üzerinden ortaya çıktığını göstermektedir. Diğer ferroptotik ve inflamatuar parametrelerdeki değişimin anlamlılığa ulaşmaması erken zaman noktasıyla ilişkili olabileceğinden, MFG-E8'in olası anti-ferroptotik rolünün ve terapötik etkinliğinin zaman ve doz bağımlı olarak değerlendirileceği ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Sepsis is a life-threatening organ dysfunction resulting from a dysregulated host response to infection; the liver is one of the organs frequently affected by sepsis and plays a key role in determining the prognosis. Ferroptosis, a controlled form of cell death characterised by iron-dependent lipid peroxidation, is thought to play a role in sepsis-associated organ damage. Milk fat globule epidermal growth factor-8 (MFGE8), which is involved in the clearance of apoptotic cells and possesses antiinflammatory properties, has emerged as a potential protective molecule in this process. The aim of this study was to investigate the effect of MFG-E8 administration on biomarkers associated with liver damage, inflammation and ferroptosis in an experimental sepsis model induced by lipopolysaccharide (LPS). Thirty-six adult male Wistar albino rats were randomized into four groups: control (K, n=8), LPS (L, n=10), LPS+MFG-E8 (LM, n=10) and MFG-E8 (M, n=8). Sepsis was induced by a single intraperitoneal injection of 2 mg/kg LPS (E. coli, O111:B4). MFG-E8 was administered intraperitoneally at a dose of 20 µg/kg one hour after LPS. In serum and liver samples taken at the sixth hour, histopathological damage (mononuclear cell infiltration, congestion, vacuolisation) was assessed using haematoxylin-eosin staining, hepatic iron stores were assessed using Prussian blue staining; serum AST and ALT levels were measured using an autoanalyser; tissue TNF-α and IL-1β levels were determined using the ELISA method; tissue Fe²⁺, MDA, total GSH and GSSH levels, in relation to ferroptosis, were measured using a colorimetric method; and GPX4 and ACSL4 protein levels were assessed using Western blot analysis. In the LPS group, mononuclear cell infiltration and congestion, serum AST and ALT levels, tissue TNF-α and IL-1β levels, as well as hepatic iron accumulation and iron levels, were found to be significantly higher than in the control group. Administration of MFG-E8 following LPS treatment significantly reduced hepatic iron accumulation compared with the LPS group. However, although a positive trend was observed in liver function tests, inflammatory cytokines and other ferroptosis markers, this was not statistically significant. These findings indicate that, in the LPS-induced sepsis model, marked acute liver damage, an inflammatory response and hepatic iron accumulation develop by the sixth hour; whilst the protective effect of MFG-E8 manifests primarily through iron metabolism in the early stages. As the lack of statistical significance in changes to other ferroptotic and inflammatory parameters may be related to the early time point, further studies are required to evaluate the potential anti-ferroptotic role and therapeutic efficacy of MFG-E8 in a time- and dose-dependent manner.