Hepatosellüler kanserde MIR100HG’nin SP1 transkripsiyon faktörü ile regülasyonu

Abstract

MIR100HG, kanser biyolojisinde önemli etkileri olan uzun kodlamayan bir RNA (lncRNA) olup, çeşitli kanser türlerinde yüksek düzeyde ifade edildiği gösterilmiştir. Bu tez kapsamında, MIR100HG'nin aşırı ekspresyonu ve baskılanmasının normoksik ve hipoksik koşullardaki hücresel etkileri, MIR100HG’nin SP1 tarafından transkripsiyonel aktivitesinin belirlenmesi ve MIR100HG promotorunda SP1 bağlanma bölgelerinin ChIP deneyi ile doğrulanması, SP1‘in normoksik ve hipoksik koşullarda hücresel ve moleküler etkilerinin belirlenmesi amaçlanmaktadır. Hep3B hücrelerinde MIR100HG'nin aşırı ekspresyonu ve kalıcı baskılanması mRNA seviyesinde doğrulanmıştır. Normoksik ve hipoksik koşullarda, MIR100HG'nin aşırı ifadesinin hücre proliferasyonunu, hücre göçünü, koloni oluşturma yeteneğini ve invazyon yeteneğini arttırdığı gösterilmiştir. Aynı şekilde korele olarak MIR100HG shRNA ile lentiviral tabanlı kalıcı olarak ifadesinin baskılanması normoksik ve hipoksik koşullarda, hücre proliferasyonunu, hücre göçünü, koloni oluşturma yeteneğini ve invazyon yeteneğini azalttığı gösterilmiştir. MIR100HG promotorunda biyoinformatik olarak çok sayıda bağlanma bölgeleri bulunan SP1 transkripsiyon faktörünün MIR100HG transkripsiyonel regülasyonuna etkileri de incelenmiştir. SP1 aşırı ifadesinin 5’ kısaltılarak oluşturulmuş MIR100HG promotor parçalarının aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. Aynı artış mRNA düzeyinde qRT-PCR ile doğrulanmıştır. DNA-protein etkileşim deneyi olan ChIP ile SP1 transkripsiyon faktörünün -260/+56 bölgelerine bağlandığı belirlenmiştir. Hep3B hücrelerinde SP1’in aşırı ekspresyonu ve kalıcı baskılanması, normoksik ve hipoksik koşullarda moleküler ve hücresel düzeyde analiz edilmiştir. SP1’in aşırı ekspresyonu ve baskılanması mRNA ve protein düzeyinde doğrulanmıştır. SP1 aşırı ifadesinde ve kalıcı baskılanmasında metastik genlerin ekspresyon seviyelerine etkileri mRNA düzeyinde belirlenmiştir. SP1 aşırı ifadesinin hücre proliferasyonunu, hücre göçünü, koloni oluşturma yeteneğini azalttığı bulunmuştur. Bu sonuçlara korele olarak SP1 shRNA ile lentiviral tabanlı kalıcı olarak ifadesinin baskılanması normoksik ve hipoksik koşullarda, hücre proliferasyonunu, hücre göçünü, koloni oluşturma yeteneğinini arttırdığı gösterilmiştir.

MIR100HG is a long non-coding RNA (lncRNA) with significant effects in cancer biology, shown to be highly expressed in various cancer types. This thesis investigates the cellular effects of MIR100HG overexpression and suppression under normoxic and hypoxic conditions, the transcriptional activation of MIR100HG by SP1, and SP1 binding sites within the MIR100HG promoter using ChIP assays. The cellular and molecular effects of SP1 under normoxic and hypoxic conditions were also examined. In Hep3B cells, overexpression and stable suppression of MIR100HG were confirmed at the mRNA level. Under normoxic and hypoxic conditions, MIR100HG overexpression enhanced cell proliferation, migration, colony formation, and invasion potential. Conversely, lentiviral-based suppression of MIR100HG via shRNA reduced these capabilities under both conditions. SP1, a transcription factor with multiple binding sites in the MIR100HG promoter, was shown to regulate MIR100HG transcription. SP1 overexpression increased the activity of truncated promoter fragments, confirmed at the mRNA level via qRT-PCR. ChIP assays demonstrated SP1 binding to the -260/+56 promoter region. In Hep3B cells, SP1 overexpression and suppression were analyzed under normoxic and hypoxic conditions. Both were confirmed at mRNA and protein levels. SP1 overexpression decreased cell proliferation, migration, and colony formation, while stable suppression via shRNA increased these activities. SP1’s effects on metastatic gene expression were assessed at the mRNA level.