Isolation of biliary lipid carrying vesicles, analysis of their biochemical properties and hepatic ABCG5 mRNA expression in diosgenin-fed rats

Abstract

Objective: An attempt was made to isolate vesicles, rich in biliary-type lipid from livers of ratsfed with diosgenin, which is reported to increase cholesterol carrying vesicles in hepatocytes, and to determine their lipid, alkaline phosphodiesterase I, protein status and hepatic ATP-binding cassette half-transporter genes 5/8 (ABCG5/ABCG8) expression. Material and Methods: The livers were removed, homogenized, subjected to centrifugation, and the microsomal fraction was obtained. This microsomal fraction was then loaded onto a 12% self generating gradients of OptiPrep (TM) in a Beckman Vti 65 vertical-tube rotor and centrifuge at 350000 xg for 90 min at 4 degrees C. The gradient fractions were analysed for total phospholipid, cholesterol, protein and alkaline phosphodiesterase I (PDE). Results: There were no differences in total phospholipid, cholesterol and protein contents of the subcellular fractions of livers from control and diosgenin fed rats. However, PDE activity was significantly lower in some subcellular fractions in diosgenin-fed rats compared to controls. The gradient fractions with density 1.05-1.07 g/ml had increased amounts of cholesterol, PDE activity and some phospholipids, but contained very little protein. However, the gradient fractions with density 1.09-1.23 g/ml were significantly rich in cholesterol, phospholipids and protein, but not PDE activity, suggesting another population of vesicles. Hepatic ABCG5 mRNA expression was increased in diosgenin-fed rats compared with the control group, although, no significant difference was found in hepatic ABCG8 mRNA expression between control and diosgenin-fed rats. Conclusion: These findings suggested that ABCG5 is involved in diosgenin induced biliary cholesterol secretion and may provide an insight into mechanisms involved in biliary lipid transport.Amaç: Hepatositlerde kolesterol taşıyıcı vezikülleri arttırdığı bildirilmiş olan diosgenin ile beslenen sıçan karaciğerlerinden, safra kökenli lipid yönünden zengin vezikülleri izole etmek ve onların lipid, alkalin fosfodiesteraz I, protein ile hepatik ATP-bağlayan kaset yarım taşıyıcı genleri 5/8 (ABCG5/ABCG8) ekspresyonlarının düzeylerinin saptanması amaçlandı. Gereç ve Yöntem: Karaciğerler alınarak, homojenize edildikten sonra santrifüjlenerek mikrozomal fraksiyonları elde edildi. Daha sonra bu mikrozomal fraksiyon, Beckman Vti 65 vertikal-tüp rotor içindeki, % 12’lik kendiliğinden gradiyent oluşturan OptiPrepTM’in üzerin konuldu ve 4°C’de, 350000 xg devirde, 90 dakika süreyle santrifüj edildi. Gradiyent fraksiyonlarının toplam fosfolipid, kolesterol, protein ve alkalin fosfodiesteraz I (PDE) için analizleri yapıldı. Bulgular: Kontrol ve diosgeninle beslenmiş sıçanlar arasında, subsellüler fraksiyonların toplam fosfolipid, kolesterol ve protein içerikleri yönünden farklılıklar bulunmadı. Bununla birlikte, diosgenin ile beslenen sıçanların, bazı subsellüler fraksiyonlarının PDE aktivitelerinin, kontrol ile karşılaştırıldığında, belirgin olarak daha düşük olduğu tespit edildi. 1.05-1.07 g/ml dansiteli gradiyent fraksiyonlarındaki kolesterol, PDE aktivitesi ve biraz da fosfolipid içeriği, daha yüksek düzeylerde bulunmalarına rağmen, çok az bir miktarda protein içeriyorlardı. Buna karşılık, 1.09- 1.23 g/ml dansiteli gradiyent fraksiyonları; kolesterol, fosfolipidler ve protein miktarları yönünden yüksek olmalarına karşılık, PDE aktivitesinde böyle bir artış olmaması, bu fraksiyonlarda diğer bir vezikül popüsyonunu olduğunu düşündürmektedir. Hepatik ABCG5 mRNA ekspresyonu, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, diosgeninle beslenen sıçanlarda istatistiksel anlamda yükselmesine rağmen, hepatik ABCG8 mRNA ekpresyonunda, kontrol ve diosgeninle beslenen sıçanlar arasında belirgin bir farklılık bulunmamıştır. Sonuç: Bu bulgular, ABCG5’in, diosgenin tarafından uyarılan safra kökenli kolesterol sekresyonuyla ilgili olduğunu göstermektedir ve safra lipid transportunda yer olan mekanizmalar hakkında yeni bir fikir sağlayabilir.