Kolon Kanserinde ADAMTS-8 Geninin Transkripsiyonel Regülasyonu ve Enflamasyon Sitokinlerinin (TNF-Alfa ve IL-6) Bu Regülasyona Olan Etkileri

Abstract

ADAMTS ailesinin üyesi olan ADAMTS-8 antianjiyogenik ve proapoptotik aktiviteye sahip aday bir tümör baskılayıcı gendir. Yaygın kanser türlerinde epigenetik mekanizmalarla susturulduğu belirlenmiştir. Literatürde normal ve kanserli dokularda ADAMTS-8 geninin metilasyon ve ekspresyon analizi konusunda çalışmalar bulunmakla birlikte transkripsiyonel düzeyde regülasyonu aydınlatılmamıştır. Bu proje temel olarak kolon kanserinde ADAMTS-8 geninin transkripsiyonel regülasyonunun ve kolon kanserinde önemli olan TNF-alfa ve IL-6 enflamasyon sitokinlerinin bu regülasyona olan etkilerinin belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Bu amaçla öncelikle bazı kolon kanseri hücre hatlarında ADAMTS-8'in mRNA (qRT-pCR) ve protein (westernblot) ekspresyonları belirlenerek SW480 hücreleri model olarak seçildi. Transkripsiyonel anlamda en aktif bölgenin belirlenmesi amacıyla beş farklı uzunlukta ADAMTS-8 promotor parçası (1177bç, 988bç, 736 bç, 549bç, 232bç) lusiferaz tabanlı plazmit vektöre klonlanarak SW480 hücrelerine geçici transfeksiyonla aktarıldı. Bütün parçaların aktif olduğu ve en küçük promotor parçasının transkripsiyonel aktivite için yeterli olduğu belirlendi. Enflamasyon sitokinleriyle ADAMTS-8 geninin regülasyonunun belirlenmesi basamağında, TNF-alfa ve IL-6 sitokinlerinin ADAMTS-8 promotor aktivitesini indükleyici yönde etki gösterdiği bulundu. TNF-alfa ve IL-6 sitokinlerinin ADAMTS-8 mRNA ve protein ekspresyon düzeylerini arttırdığı belirlendi. Yolak inhibisyon çalışmaları enflamasyon sitokinleri aracılı bu indüklemede p38/MAPK, MEK, JNK, PI3K ve NF-Kß sinyal iletim yollarının görev yaptığını göstermiştir. Ek olarak ADAMTS-8 geninin sitokin aracılı regülasyonunda görev yapabilecek olan spesifik moleküllerin fosforillenmiş formunu tanıyan antikorlarla yapılan çalışmalar yolak inhibisyon çalışmalarını doğrular nitelikte bulunmuştur. Projenin son basamağında TNF-alfa ve IL-6 sitokinlerince stimüle edilen transkripsiyon faktörlerinden STAT, NF-Kß, CREB, ELK-1, ATF-1 ve c-Jun'un ADAMTS-8 promotorunda biyoinformatik analizlerle belirlenmiş olan 6 adet muhtemel bağlanma bölgesine farklı bağlanma özelliği gösterdikleri belirlendi. Bu proje ile kolon kanserinde tümör süpresör potansiyeli olan ADAMTS-8 geninin promotor bölgesi ik kez klonlanarak fonksiyonel analizleri yapılmıştır. Ayrıca TNF-alfa ve IL-6 sitokinlerinin ADAMTS-8 promotor aktivitesi, mRNA ve protein ekspresyonları indükleyici yönde etki gösterdiği bulunmuştur. Bu indüksiyonda p38/MAPK, MEK, JNK, PI3K ve NF-Kß sinyal iletim yollarının rol oynadığı belirlenmiştir. Ek olarak STAT, NF-Kß, CREB, ELK-1, ATF-1 ve c-Jun transkripsiyon faktörlerinin ADAMTS-8 promotorundaki bazı bölgelere fonksiyonel olarak bağlandığı aydınlatılmıştır.