Yönlendirilmiş mutagezen ile mutant HCAII geninin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması

Abstract

Karbonik anhidraz enzimleri (Karbonat hidroliyaz, CA, E.C.4.2.1.1), CO2 ve H2O’den HCO3 - iyonlarının geri dönüşümlü reaksiyonunu katalizleyen bir enzim ailesidir. α, β, γ, δ ve ε-CA olarak bilinen evrimsel olarak ilgisiz beş CA gen ailesi vardır. Hayvanlar alemindeki bütün CA’lar α tipindedir. İnsanları da kapsayan yüksek omurgalılarda, çok farklı hücresel yerleşimler ve doku dağılımları ile 14 farklı α-CA izoenzimi saptanmıştır. HCAII enzimi asetazolamid, sulfonamid, metazolamid ve diklorfenamid gibi glaucoma tedavisinde kullanılan ilaçların hedefidir. Fakat sulfonamidlerin 14 izoformu içeren CA izoenzimlerine karşı spesifikliği düşüktür ve ilgili hastalıkların tedavi sürecinde yan etkilerle karşılaşılabilir. Bu yüzden enzimin inhibisyon mekanizmasının daha spesifik inhibitörlerin geliştirilmesi için aydınlatılması önemlidir. Bu çalışmanın amacı katalitik merkezle ilgili olan bazı amino asitleri ortaya çıkarmaktır. PCR’a dayalı olarak kullanılan yönlendirilmiş mutagenez, Asparajin67 aminoasiti hidrofob Izolösin amino asitiyle, Lösin204 aminoasiti hidrofil Serin aminoasiti ile değiştirilmesinde kullanılmıştır. Mutant ve yabani tip proteinlerin ekspresyonu E.coli’de optimize edilen koşullarda IPTG kullanılarak yapıldı. pET31b vektörü içerisindeki mutant HCAII proteinlerinin ekspresyonu BL21 hücrelerinde IPTG indüksiyonu ile yapıldı. Ekspre edilen proteinlerin saflaştırılması CA spesifik afinite kromatografisi ile yapıldı. Mutant ve yabani tip enzimlerin saflıkları SDS-PAGE elektroforezi ile kontrol edildi. Ekspre edilen proteinlerin miktarları Breadford yöntemi ile hesaplandı. Mutant ve yabani tip enzimlerin CO2 hidratasyon aktivitesi ölçüldü. Mutant ve yabani tip enzimlerin, glaucoma hastalığı tedavisinde yaygın olarak kullanılan inhibitörlere (sülfonamid ve asetazolamid) karşı inhibisyonları ve IC50 değerleri belirlendi. Asn67Ileu mutant HCAII enziminin 2,1x10-5 M ve 0,0285 x10-3 mM olan IC50 değerleriyle mutant enzime göre inhibisyonu daha fazla olarak gözlendi. Tersine Leu204Ser mutant enzimin asetazolamid ve sülfonamid inhibitörlerine karşı inhibisyonu 2,52 x10-5 M ve 0,422 x10-3 mM IC50 değerleriyle daha düşük olarak tespit edildi.Carbonic anhydrases (CAs) are a family of enzymes which catalyse the reversible reaction from H2O and CO2 to HCO3 - ions. There are five evolutionarily unrelated CA families, designated α, β, γ, δ ve ε-CA. All known CAs from the animal kingdom are of the alpha type. There are fourteen mammalian CA isozymes with different tissue distributions and intracellular locations, in higher vertebrates, including human. The HCAII enzyme is the target for drugs, such as acetazolamide, methazolamide and dichlorphenamide for the treatment of glaucoma. However, since the specificity of sulphonamides against CA enzymes that consist of 14 isoforms is low, the adverse effect could be encountered during the treatment of the related diseases. Therefore, it is important to to elucidate the inhibition mechanism of the enzyme in order to develop more specific novel inhibitors. Thus, the aim of the study is to identify some amino acids that may be involved in catalytic centre. PCR Site directed mutagenesis strategy has been performed replacing Asn67 to a hydrophobic amino acid, Isoleucin and Leu204 to hydrophilic amino acid, Serin. The expression of the mutant protein was performed in E coli with the optimized condition by inducing IPTG. Mutant HCAIIs in pET31b vector were expressed in BL21 cells by including IPTG. The expressed proteins were purified by CA specific affinity chromatography. Integrity of mutant and wild type enzyme was checked by SDS-page analysis. Bradford assay was performed for determination of concentrations of expressed proteins. CO2 hydration activity of mutant and wild-type enzymeswas performed. Inhibition of these mutant and wild type enzyme was determined by IC50 values against some inhibitors (sulphonilamide and acetozolamide) widely used for the threatment of glaucoma. Asn67ILeu mutants has higher inhibition affinity than wild type with IC50 values of 2,1x10-5 M, 0,0285 x10-3 mM. In contrast Leu204Ser mutant has lower affinity to sulphonilamide and acetozolamide than the wild-type HCAII with 2,52 x10-5 M, 0,422 x10-3 mM.