Zeytin beta glukozidaz ve metalotionein genlerinin moleküler, fizyolojik ve biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, zeytin (Olea europaea L.) bitkisine ait beta glukozidaz (ZBG) ve tip II metalotiyonein genleri (OeMT2), moleküler, fizyolojik ve biyokimyasal olarak karakterize edilmiştir. Daha önce yapılan çalışmalarda sadece cDNA dizisi bulunan bu iki genin; intron tespiti, biyoinformatik araçlarla analizi, çeşitler arası polimorfizm tespiti, kopya sayısı, zeytin bitkisinde dokusal ve zamansal ekspresyon profili, bakteriyel ekspresyonu, protein karakterizasyonu ve biyolojik aktivite çalışmaları yapılmıştır. Verilerin değerlendirilmesi sonucunda, ZBG geninin 9 adet intron içerdiği belirlenmiştir. 5' UTR bölgesine ait yaklaşık 344 nükleotit uzunluğunda dizi elde edilmiştir. Yapılan polimorfizm çalışmasında ZBG geninin polimorfik olduğu ve Ayvalık çeşidine en uzak Gordales çeşidinin olduğu görülmektedir. Domat, Picual ve Koroneiki çeşitleri ise ZBG geni açısından Ayvalık çeşitine daha yakın görülmektedir. Anlık gösterimli PZR analizleri; ZBG geninin tek kopyalı olduğunu, var yılı ya da yok yılına özgün olmadığını, zeytin dokularından en fazla meyvede ve kasım ve aralık aylarında ifade edildiğini gösterdi. Biyokimyasal karakterizasyon sonuçları ZBG proteininin yaklaşık 67 kDa ağırlığında olduğunu, optimum pH değerinin 8.0, optimum sıcaklığının 37 °C olduğunu, pNPGlu substratına karşı Vmax değerinin 25.25 EU, Km değerinin ise 5.14 mM olduğunu belirledi. Demir ve Mangan ZBG enzimini active ederken, δ-glukanolakton, glukoz, bakır, nikel, kadmiyum ve çinkonun da enzimin inhibitörleri olduğu belirlendi. OeMT2 geninin 2 adet intron içerdiği ve tek kopya olarak zeytin genomunda temsil edildiği tespit edildi. OeMT2 geninin hemen hemen tüm zeytin dokularında benzer oranda ifade edildiği ve polimorfik bir gen olduğu kanıtlandı. Proteinin moleküler ağırlığının yaklaşık 22 kDa olduğu ve biyolojik aktivite analizi sonucu bakır ve kadmiyum elementlerini etkin bir şekilde bağladığı tespit edildi.

In this study, a ß glucosidase gene (ZBG) and a type II metallothionein gene (OeMT2) from olive (Olea europaea L.) were characterized with respect to molecular, physiological and biochemical aspects. Previous studies reported only a cDNA sequence for both of the genes which were investigated in this thesis for intron determination, bioinformatic analysis, polymorphism study among olive cultivars, copy number determination, expression profile (in different tissues with regard to alternate bearing), protein expression, characterization and biological activities. The results revealed the first data about the genes, and revealed that ZBG has 9 introns. 344 bp of 5' UTR region of the gene was identified. ZBG displayed a polymorphic seqeunce among cultivars. Domat, Picual and Koroneiki cultivars were the closest cultivars to Ayvalik whereas Gordales was the furthest among the olive cultivars examined. Real - time PCR studies suggested that ZBG was represented as a single copy gene in olive genome, has probably no function associated with alternate bearing in olive and highly expressed in fruits, comparing to olive tissue and organs, especially on November and December. Biochemical characterization results suggested that; MW of ZBG protein is 67 kDa, optimum pH is 8.0; and optimum temperature of the enzyme is 37 °C, Vmax is 25.25 EU and Km value is 5.14 mM. While iron and manganese were the activators of the ZBG enzyme, δ-glucanolactone, glucose, cupper, nickel, cadmium and zinc were the inhibitors. OeMT2 gene had 2 introns and it was represented as a single copy gene in olive genome. OeMT2 gene had more or less the same expression profile in all olive tissue and organs tested. It was al also a polymorphic gene. It has a 22 kDa MW and its biological activity revealed that OeMT2 binds cupper and cadmium effectively.