Polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve bazı bileşiklerin bu enzim üzerindeki etkilerinin araştırılması

Abstract

Polifenol oksidaz enzimi, Sepharose 4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite kromotagrafisi jeli kullanılıp Musa sapientum var. Cavendishii (Muz) meyvesinden saflaştırılmıştır. Saflaştırdığımız enzimin aktivitesi üzerinde 44 adet orijinal Flavonoid türevlerinin etkileri araşırılmıştır. 44 maddenin tamamı PPO enzimini inhibe etmiştir. En güçlü inhibitör özelliğini 7-O-sellebiyozil apigenidin ([IC50]=10.7 μM, Ki=7.45 μM ) bileşiği göstermiştir. Ayrıca, PPO enziminin saflaştırılması için kullanilan Sepharose 4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite kromotagrafisi jeline ilaveten iki yeni afinite kromatografisi jeli sentezlenmiştir. Bu jeller, CNBr ile aktive edilen Sepharose-6B ve Sepharose-4B’ye uzantı kolu olarak anilin bağlandıktan sonra p-aminobenzoik asitin aniline kenetlenmesi sonucu elde edilmiştir. Her iki jellede aynı enzim kaynağı kullanılarak PPO enzimi saflaştırılmıştır. Sepharose-4B ve Sepharose-6B içeren jeller kullanılarak sırasıyla, %7.05 - %4.49 verim ve 105.042 - 33.4 saflaştırma derecesine ulaşılmıştır. Enzimin saflığı ve molekül ağırlığı, SDS-PAGE ile kontrol edilmiştir. Daha sonra 4 adet pestisitin, PPO enzim aktivitesi üzerindeki etkileri araştırılmış ve söz konusu enzimi inhibe ettikleri tespit edilmiştir. Aralarında en güçlü inhibitörün Glifosfat izopropil amin ([IC50]=33.5 mM, Ki=20.7 mM) olduğu saptanmıştır.

Polyphenol oxidase enzyme was purified from Musa sapientum var. Cavendishii (banana) by using Sepharose 4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity gel. In this study, 44 original flavonoide derivatives used to investigate their effects on the pure enzyme activity. All of the 44 compounds inhibited the PPO enzyme activity. The most powerful inhibitor is 7-O-cellobiosile apigenidine ([IC50]=10.7 μM, Ki=7.45 μM ). In addition to Sepharose 4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity gel, two novel affinity chromatography gels were synthesized for purifing PPO enzyme. The affinity chromatography gels were synthesized by coupling aniline as a spacer arm to CNBr activated Sepharose-4B and Sepharose-6B. Then, p-amino benzoic acid was coupled to aniline as a ligand. PPO was purified from the same enzyme source by using the gels. 7.05 % –4.49 % yield and 105.042 – 33.4 fold purification were achieved from the gel contain Sepharose-4B and Sepharose-6B, respectively. Purity and molecular weight of the enzyme were controlled with SDS-PAGE. Then, four pesticides’ effects on the pure enzyme activity were investigated. The results showed that all of the pesticides inhibited the enzyme activity. Among the four pesticides that tested, Glyphosate isopropylamine was found to be the most powerful inhibitor with [IC50]=33.5 mM, Ki=20.7 mM.