Nükleik asit tayinine yönelik elektrokimyasal genosensör dizaynı

Abstract

Günümüzde, LNA probların elektrokimyasal hibridizasyon analizi geliştirmesinde kullanımı giderek artmaktadır. RNA benzeri bir nükleik asit olan LNA, riboz şekerinin furanoz halkasının kimyasal olarak 2´oksijeni ile 4´ karbon atomunu bağlayan bir metilen köprüsü içerir. LNA problar mikro RNA'ların belirlenmesinde kullanılmaktadır. Mikro RNA'lar (miRNA yada miR) ufak, tek zincirli kodlama yapmayan ~18-24 nükleotidlik RNA'lardır ve miRNA'ların çeşitli kanserlerle ilişkileri keşfedilmiştir. Dizideki tek bir bazın farklılaşması ile miRNA'lar birbirlerinden ayrılırlar. Tek bir miRNA'yı belirlemek için yüksek seçicilikte prob dizaynı önemlidir. Bu çalışmada, mikro RNA dizilerinin belirlenmesi için prob altın perde baskılı elektroda kovalent olarak immobilize edilerek elektrokimyasal genosensör dizaynı amaçlanmıştır. İmmobilizasyon sonucunda, streptavidin-enzim kompleksi ile hibritin etiketlenmesiyle enzimatik ürünün elektrokimyasal olarak belirlenmesi tek kullanımlık elektrot yüzeyinde gerçekleştirilmiştir. DNA ve LNA probların biyotinlenmiş DNA ve RNA hedeflerle hibridizasyonu araştırılmıştır. Kronik lenfositik lösemi'nin (CLL) belirlenmesi için dizayn edilen genosensörde tek kullanımlık perde baskılı elektrotlar, differansiyel puls voltametrisi yöntemi kullanılarak elde edildi. Spektrofotometrik deneyler ile DNA ve LNA probların çözelti içerisindeki davranışları incelendi. Spektrofotometrik erime noktası tayinlerinde tam eşleşen hibritler ile bir bazın yanlış eşleştiği hibritlerin erime noktaları arasındaki farklar (ΔTm) 100 mM sodyum fosfat tamponu (pH 7.0) içerisinde DNA-DNA çiftleri için 11.53 °C, LNA-DNA çiftleri için 12.55 °C, DNA-RNA çiftleri için 12.71 °C olarak hesaplanmıştır. İyonik şiddeti azaltmak için tuz konsantrasyonunun 1 mM'a indirilmesiyle erime noktaları arasındaki farklar DNA-DNA çiftleri için 10.29 °C, LNA-DNA çiftleri için 11.51 °C, DNA-RNA çiftleri için 14.28 °C ve LNA-RNA çiftleri için 13.49 °C olarak hesaplanmıştır. Elektrokimyasal hibridizasyon analizlerin tayin sınırları DNA-DNA, DNA-RNA, LNA-DNA ve LNA-RNA analizlerinde sırasıyla 70 pM, 80 pM, 70 pM, 70 pM olarak belirlenmiştir.

Development of electrochemical hybridization assay by using LNA capture probes are increasing nowadays. LNA is a nucleic acid analogue of RNA in which the furanose ring of the ribose sugar is chemically locked by the methylene linkage of 2´O and 4´C. LNA probes are used for detecting miRNAs. Micro RNAs (miRNAs or miRs) are small, single stranded, non-coding RNAs of ~18-24 nucleotides and miRNAs are related with many cancer diseases. They are characterized by a great variability of sequences, distinguishing only a single base from each other. It is particularly important to design high selective capture probes for discriminating only one miRNA. In this study, we aimed to design a genosensor by covalent bonding probe immobilization on screen printed gold electrode. After having this immobilization, electrochemical detection of enzymatic product of the labeled hybrid with enzyme-streptavidine complex was performed onto the surface of a disposable electrode. The hybridization of DNA, LNA immobilized probes with biotinylated DNA and RNA targets were also investigated. Disposable screen printed electrodes were used as transducer and differential pulse voltammetry was used as an electrochemical technique to design genosensor for detecting chronic lymphocytic leukemia (CLL). Spectrophotometric experiments were performed in order to investigate the hybridization behavior of DNA and LNA probes in solution. Spectrophotometric melting point detections were performed to calculate the difference between perfect matched hybrids and one base mismatched hybrids (ΔTm) in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), ΔTm's calculated 11.53 °C for DNA-DNA duplex, 12.55 °C for LNA-DNA duplex, 12.71 °C for DNA-RNA duplex. ΔTm's were calculated as 10.29 °C for DNA-DNA duplexes, 11.51 °C for LNA-DNA duplexes, 14.28 °C for DNA-RNA duplexes and 13.49 °C for LNA RNA duplexes with decreasing the ionic strength by lower salt concentration as 1 mM. Detection limits of electrochemical hybridization assays were calculated for DNA-DNA, DNA-RNA, LNA-DNA and LNA-RNA assays as 70 pM, 80 pM, 70 pM, 70 pM, respectively.