Trichomonas vaginalis’in tanısında konvansiyonel yöntemlerin moleküler yöntemlerle karşılaştırılması ve metronidazol direncinin araştırılması

Abstract

Trikomoniyaz, Trichomonas vaginalis’in etken olduğu ve cinsel yolla bulaşan parazit kaynaklı bir enfeksiyondur. Trikomoniyaz tanısında, duyarlılığı düşük olmakla birlikte, ucuz ve hızlı bir yöntem olan direkt mikroskopi (DM) tercih edilmektedir. Altın standart olarak kabul edilen kültür yöntemleri ise, duyarlılığının yüksek olmasına karşın, deneyimli personel gereksinimi ve 2-7 gün içinde sonuç alınması nedeniyle ancak belirli merkezlerde uygulanabilmektedir. Bu çalışmada, T.vaginalis’in rutin tanısında kullanılan konvansiyonel mikroskobik ve kültür yöntemlerinin polimeraz zincir reaksiyonu [polymerase chain reaction (PCR)] yöntemiyle karşılaştırılması ve klinik örneklerden izole edilen T.vaginalis izolatlarında, metronidazol direnciyle ilişkili olduğu düşünülen nitroredüktaz gen bölgesindeki ntr4 ve/veya ntr6 gen polimorfizminin araştırılması amaçlanmıştır. Mart 2019-Ağustos 2021 tarihleri arasında, Balıkesir Üniversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Hastanesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Polikliniğine başvuran 200 hastanın jinekolojik muayenelerinde, vajina arka forniksten iki adet steril eküvyon ile vajinal sürüntü örneği toplanmıştır. İlk sürüntü örneği doğrudan mikroskobik inceleme, Giemsa boyama ve konvansiyonel PCR çalışması için kullanılmış; ikinci sürüntü örneği ise T.vaginalis kültürü için “trypticase-yeast-extract-maltose (TYM)” besiyerine alınmış ve 37 °C’de sekiz gün boyunca takip edilmiştir. Tüm örnekler T.vaginalis varlığı açısından, ?-tubulin (btub1) gen bölgesine özgü primerler ve TYM besiyerinde üretilen T.vaginalis suşları metronidazol direnci açısından nitroredüktaz gen bölgesine özgü primerler ile konvansiyonel PCR kullanılarak incelenmiştir. Metronidazol direnciyle ilişkili polimorfizm saptanan izolatlara ayrıca ilaç direnç testi uygulanmıştır. Çalışmaya dahil edilen 200 hasta örneğinin sekizi (%4) hem kültür/boyama hem de PCR yöntemiyle pozitif bulunmuştur. Hastaların yaş ortalaması 39.9 iken T.vaginalis pozitif saptanan hastaların yaş ortalaması 41.8 olarak saptanmıştır. Hastalarda en sık rastlanan klinik bulguların, kötü kokulu vajinal akıntı (%36), kasık ağrısı (%21), vajinal kaşıntı (%19) ve idrar yaparken yanma (%18) olduğu tespit edilmiştir. Klinik örneklerden izole edilen sekiz adet T.vaginalis izolatının üçünde, PCR ile metronidazol direnciyle ilişkili olduğu düşünülen ntr6 gen polimorfizm varlığı gösterilmiştir. ntr6 gen polimorfizmi tespit edilen üç izolatın, fenotipik olarak da metronidazole dirençli (MLK= 390 µM) olduğu gözlenmiştir. Bu çalışmada, sekiz klinik izolattan üçünün sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle metronidazole dirençli olmasının yanı sıra ntr6 gen polimorfizmi de göstermeleri, metronidazol direnciyle ntr6 gen polimorfizmi arasında yakın bir ilişki olabileceği tezini desteklemektedir. Sonuç olarak, T.vaginalis tanısında, mikroskopi yöntemine ek olarak, kültür ve moleküler yöntemlerin de kullanılması, etkenin laboratuvar tanısının dahadoğru olmasına, metronidazol direncinin moleküler ve fenotipik olarak tespit edilebilmesine, ülkemizdeki metronidazol direnç oranlarının belirlenmesine ve tedavi protokollerinin bu veriler çerçevesinde güncellenmesine katkı sağlayabilir.

Trichomoniasis is a sexually transmitted parasitic infection caused by Trichomonas vaginalis. In the diagnosis of trichomoniasis, direct microscopy (DM) is preferred, which is a cheap and fast method, although it has low sensitivity. Culture methods, which are accepted as the gold standard, can only be applied in certain centers due to the need for experienced personnel and the ability to get results within 2-7 days, despite their high sensitivity. In this study, it was aimed to compare conventional microscopic and culture methods used in the routine diagnosis of T.vaginalis with polymerase chain reaction (PCR) method and to investigate ntr4 and/or ntr6 gene polymorphism in the nitroreductase gene region, which are thought to be associated with metronidazole resistance in T.vaginalis strains isolated from clinical specimens. Vaginal swab specimens were collected from the posterior fornix of the vagina with two sterile ecuvion sticks during the gynecological examinations of 200 patients who applied to the Balıkesir University Health Practice and Research Hospital, Obstetrics and Gynecology Polyclinic between March 2019 and August 2021. The first swab sample was used for direct microscopic examination, Giemsa staining and conventional PCR analysis, while the second swab specimen was taken into trypticase-yeast-extract-maltose (TYM) medium for T.vaginalis culture and followed for eight days at 37 °C. All specimens were screened for the presence of T.vaginalis using primers specific to the β-tubulin (btub1) gene region and clinical isolates grown in TYM medium were examined for metronidazole resistance using primers specific for the nitroreductase gene region by using conventional PCR. Drug resistance test was also performed for the isolates in which polymorphism associated with metronidazole resistance was detected. Eight (4%) of 200 patient specimens were found positive by both culture/staining and PCR methods. The mean age of the patients included in the study was 39.9, while the mean age of the patients with positive T.vaginalis was 41.8. The most common clinical findings in the patients were foul-smelling vaginal discharge (36%), groin pain (21%), vaginal itching (19%), and burning sensation during urination (18%). In three out of eight T.vaginalis strains isolated from clinical samples, the presence of polymorphism in the ntr6 gene, which is thought to be associated with metronidazole resistance, was demonstrated by PCR. It was observed that three isolates with ntr6 gene polymorphism were phenotypically resistant to metronidazole (MLK= 390 µM). In this study, the fact that three of eight clinical isolates that were resistant to metronidazole by the broth microdilution method and as well as showing ntr6 gene polymorphism supported the thesis that there might be a close relationship between metronidazole resistance and ntr6 gene polymorphism. As a result, the use of culture and molecular methods in the diagnosis of T.vaginalis, in addition to the microscopy method, may contribute to a more accurate laboratory diagnosis of the agent, to detect metronidazole resistance molecularly and phenotypically, to determine metronidazole resistance rates in our country and to update treatment protocols within the framework of these data.