Trichothecium roseum'dan Katı Substrat Fermentasyonu ile β-glukosidaz üretimi, saflaştırılması ve biyokimyasal özellikleri

Abstract

Bu çalışmada, Katı Substrat Fermentasyonu (KSF) kültür koşullarında pirinç kabuğunun substrat olarak kullanılmasıyla Trichothecium roseum'dan elde edilen β-glukosidaz enzimi, Amonyum Sülfat Çöktürmesi ve Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (HEK) yöntemleriyle saflaştırılmıştır. T. roseum'un KSF ortamında β-glukosidaz enzimi üretimi için ihtiyaç duyduğu optimum koşullar; nemlendirme sıvısı Disodyum Monohidrojen Fosfat (Na2HPO4); optimum pH 8,5;optimum sıcaklık 30°C ve optimum inkübasyon süresi 6 gün olarak belirlenmiştir. Elde edilen β-glukosidaz enziminin saflaştırma oranı %27,24 verim ile 21,90 kat olarak hesaplanmıştır. Enzimin saflığı ve alt birim varlığı/sayısının kontrolü SDS-PAGE ve NATIVE-PAGE olmak üzere iki farklı elektroforetik yöntemin kullanılmasıyla sağlanmıştır. Saflaştırılan β-glukosidaz enziminin büyüklüğü SDS-PAGE görüntüsünde yaklaşık 38 ve 60 kDa bölgesinde iki bant olarak, NATIVE-PAGE görüntüsünde de yaklaşık 98 kDa bölgesinde tek bant olarak saptanmıştır. Bu verilere göre;β-glukosidaz enziminin 98 kDa büyüklüğünde ve iki alt üniteden oluştuğu saptanmıştır. β-glukosidaz enzim aktivitesinin belirlenmesinde ise p-nitrofenil-β-D-glukopiranosit (pNPG) substratı kullanılmış ve β-glukosidaz enziminin yüksek aktivite gösterdiği optimum pH değeri ve optimum sıcaklık değerleri sırasıyla pH 4,0 ve 55°C olarak tespit edilmiştir. Saflaştırılmış enzimin Km ve Vmax değerleri ise sırasıyla 0,25 mM ve 1250 EU olarak belirlenmiştir. Ayrıca, β-glukosidaz enzimi üzerinde, D-(+)-glukoz ve δ-glukonolakton inhibitörlerinin, pNPG substratı varlığında iki inhibitörün de kompetitif (yarışmalı) tipte inhibisyon etkisi gösterdiği belirlenmiştir. D-(+)-glukoz inhibitörünün IC50 ve Ki değerleri sırasıyla 6,20 mM ve 2,16x10-4 ± 1,0x10-4, δ–glukonolakton inhibitörünün IC50 ve Ki değerleri ise sırasıyla 6,22 mM ve 8,71x10-6 ± 1,92x10-7olarak belirlenmiştir.

In this study, the β-glucosidase enzyme was purified by ammonium sulfate precipitation and Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) which was obtained from Trichothecium roseum by using rice husk as substrate under culture conditions of Solid Substrate Fermentation (SSF). Optimum conditions for the production of β-glucosidase enzyme from T. roseum by SSF medium; the humidifying liquid Disodium Monohydrogen Phosphate (Na2HPO4) was determined as optimum pH 8.5, optimum temperature 30°C and optimum incubation period of 6 days. The purification rate of β-glucosidase enzyme obtained was calculated as 21.90 fold in 27.24% yield. The control of purity and subunit presence/number of enzyme was achieved by using two different electrophoretic methods, SDS-PAGE and NATIVE-PAGE. Size of purified β-glucosidase enzyme was detected as two bands in the SDS-PAGE image at approximately 38 and 60 kDa region, and as a singleband at the 98 kDa region in NATIVE-PAGE image. According to these data, it was found that the β-glucosidase enzyme consists of two subunits with a size of 98 kDa. In the determination of β-glucosidase activity, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) substrate was used and the optimum pH value and optimum temperature values of the β-glucosidase enzyme were determined as pH 4.0 and 55 °C, respectively. Km and Vmax values of the purified β-glucosidase was determined as 0.25 mM and 1250 EU, respectively. In addition, it has been determined that the inhibitors D-(+)–glucose and δ-gluconolactone have a competitive effect on the β-glucosidase in the presence of the pNPG substrate. IC50 and Ki values of D-(+)–glucose inhibitor were 6.20 mM and 2.16x10-4 ± 1.0x10-4 and IC50 and Ki values of δ-gluconolactone inhibitor were 6.22 mM and 8.71x10-6 ± 1.92x10-7, respectively.