Ksantin oksidaz (XO) enziminin saflaştırılması için yeni bir afinite jelinin sentezi, saflaştırılan enzim ile tiyosemikarbazon türevlerinin biyotransformasyonu ve bazı antibiyotiklerin enzim üzerindeki etkilerinin araştırılması

Abstract

Ksantin oksidaz (XO), pürin metabolizmasında anahtar role sahiptir. Bunun yanında XO, NAD+'nın rejenerasyonu, demir absorpsiyonu ve mobilizasyonu, nitratların indirgenmesi gibi biyolojik fonksiyonlarıyla dikkat çeken bu enzimi saflaştırmak için yeni bir afinite kromatografisi jeli sentezlenmiştir. Afinite kromatografisi jeli, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B'ye uzantı kolu olarak L-tirozin bağlandıktan sonra, ligand olarak 4-aminobenzamidinin L-tirozine kenetlenmesi sonucu sentezlenmiştir. Sentezlenen afinite jeli ile uygulanan afinite kromatografisi ve amonyum sülfat çöktürmesi yöntemleri kullanılarak sütten XO enzimi saflaştırılmıştır. Saflaştırılan XO enzimi SDS poliakrilamid jel elektroforezine uygulanarak yaklaşık 150 kDa molekül ağırlığına sahip tek bant elde edilmiştir. Klinikte yaygın olarak kullanılan Gentamisin sülfat, Sodyum ampisilin, Sefazolin sodyum, Klaritromisin, Rifamisin SV, Klindamisin fosfat ve Kanamisin sülfat antibiyotiklerin saflaştırılmış serum XO enzimi üzerindeki in vitro etkileri belirlenmiştir. Makrolid grubu antibiyotiklerden, Gentamisin sülfat ve Kanamisin sülfatın XO enzimi üzerine etkisi incelendiğinde Gentamisin sülfatın enzim aktivitesini arttırdığı fakat kanamisin sülfatın inhibisyon etkisi olduğu gözlenmiştir. Ayrıca Sodyum ampisilin ve Rifamisin SV'nin de belirli bir aktivasyona sebep olduğu görülmektedir. Sefazolin sodyum, Klaritromisin ve Klindamisin fosfatın XO enzimi üzerine inhibisyon etkisi olduğu gözlenmiştir. Çalışılan antibiyotikler içerisinde 5,4x10-4 mg/mL IC50 değeriyle Sefazolin sodyum en güçlü inhibitör olarak bulunmuştur. Bu değer söz konusu enzimin klasik inhibitörleri için bulunan değerlere yakın bir değerdir. Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzamidin yapılı afinite jeli kullanılarak saflaştırılan XO enziminin kinetik sabitleri (KM ve Vmax ) ksantin ve orijinal olarak sentezlenen tiyosemikarbazon bileşikleri substrat olarak kullanılarak belirlenmiştir. Ksantin substrat olarak kullanıldığında Lineweaver-Burk grafiklerinden elde edilen KM ve Vmax değerleri sırasıyla1.7x10-4 M ve 0,58 U/mL.dak olarak bulunmuştur. Literatürde XO enzimi enziminin ksantin substratına karşı Vmax ve KM değerleri tarafımızdan tespit edilen Vmax ve KM değerleri ile benzerlik göstermektedir. Tiyosemikarbazon bileşiklerinin farklı pH tamponları kullanılarak yapılan çalışmalarda her bir bileşiğin KM ve Vmax değerleri belirlenmiş ve bu bileşiklerinde substrat olarak kullanılacağı bulunmuştur. Araştırmamızda, ayrıca saflaştırılan enzimin, yeni sentezlenen tiyosemikarbazon türevleri üzerindeki etkisi incelenmiştir. Orijinal olarak sentezlenen tiyosemikarbazon bileşikleriyle yapılan biyotransformasyon işleminde, özellikle dörtlü halkada parçalanma gözlenmiştir. Elde edilen sonuçların sentetik organik kimya açısından önemli olabileceği düşünülmüş ve biyotransformasyonda kullanılmıştır.

In this study, a novel affinity chromatography gel was synthesized for purification of xanthine oxidase (XO) which has important physiological function in purine metabolism with regeneration of NAD+, absorption and mobilization of ferrous and reduction of nitrate.The gel was synthesized with Sepharose-4B-L-tyrosine and 4-aminobenzamidine as an affinity ligand. Sepharose-4B was activated with CNBr and then L-tyrosine was added as a spacer arm. Xanthine oxidase was precipitated with ammonium sulfate and purified with synthesized affinity chromatography gel. On SDS-polyacyrilamide gel electrophoresis, purified xanthine oxidase gave a single band on SDS-PAGE with about weight of 150 kDa. The effect of some antibiotics which is commonly used in clinical on purified xanthine oxidase was determined in vitro. The name of antibiotics was Gentamycin sulfate, Sodium ampicillin, Cefazolin sodium, Chlarithromycin, Rifamycin SV, Clindamycin phosphate and Kanamycin sulfate. Macrolid group of antibiotics, the effects of Gentamycin sulfate and Kanamycin sulfate were determinated on purified xanthine oxidase. Gentamycin sulfate increased xanthine oxidase enzyme activity but kanamycin sulfate caused an inhibitory effect on xanthine oxidase enzyme activity. In addition, sodium ampicillin and rifamycin SV caused activation on enzyme activity. Cefazolin sodium, Chlarithromycin and Clindamicin phosphate indicated inhibitory effect on xanthine oxidase enzyme activity. Cefazolin sodium is the most effective inhibitor in studied antibiotics with the value of 5,4 x10-4 mg/mL. This value is close to the other values found for XO's classical inhibitors. The kinetic constants (KM ve Vmax) of XO which was purified with the structure of Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzamidine affinity gel were determinated with xanthine and originally synthesized thiosemicarbazone derivates. The values of KM and Vmax are 1.7x10-4 M ve 0, 58 U/mL.min., respectively, that using to xanthine as a substrate. The values are similar to other studies that used to xanthine as a substrate. In this study, KM and Vmax values for thiosemicarbazone derivates were determinated by using different pH buffer solutions. The results indicated that these compounds can be used as a substrate. In this study, the effect of purified XO on original thiosemicarbazone derivatives was examined. In biotransformation process via originally synthesized thiosemicarbazone compounds, especially in quartet rings, a degradation was observed. These results were important in synthetic organic chemistry and we used these compounds in biotransformation.