Katı substrat fermantasyonu ile trichoderma harzianum da selülaz üretimi, saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi

Abstract

ß-glukosidaz, çeşitli temel biyolojik süreçlerde önemli rol oynamaktadır. Bu çalışmada Trichoderma harzianum NRRL 13019’ dan elde edilen ß-glukosidaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi ve Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (Sepharose-4B-L-Tirozin-1-Naftilamin) ile saflaştırılmıştır. ß-glukosidaz enzimi, NaH2PO4 (pH 7), ile nemlendirilmiş öğütülmüş mısır koçanının substrat olarak kullanılması ile Trichoderma harzianum NRRL 13019 suşundan elde edilmiştir. Katı hal fermantasyonu ile T. harzianum NRRL 13019’ dan enzimin üretimi için optimum koşullar, 25 °C ve 7 gün olarak belirlenmiştir. T. harzianum’ dan elde edilen ß-glukosidaz enzimi %18,02 verim ile 29,10 kat saflaştırılmıştır. ß-glukosidaz enziminin SDS-PAGE/NATİVE-PAGE olmak üzere iki farklı elektroforez yöntemi ile saflığı ve alt birim varlığı/sayısı kontrol edilmiştir. Saflaştırılan enzim NATİVE ve SDS-PAGE üzerinde tek bir bant olarak göç etmiştir. ß-glukosidaz enziminin monomerik yapıda ve 110 kDa ağırlığında olduğu belirlenmiştir. ß-glukosidaz enzim aktivitesinin belirlenmesinde ise p-nitrofenil-ß-D-glukopiranosit (pNPG) substratı kullanılmıştır. ß-glukosidaz enziminin yüksek aktivite gösterdiği optimum pH değeri ve optimum sıcaklık değeri sırasıyla pH4 ve 65°C olarak tespit edilmiştir. ß-glukosidaz enziminin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,334 mM ve 3333,334 EU olarak belirlenmiştir. Lineweaver-Burk grafiğinden yararlanılarak, δ-glukonolakton ve D(+)glukozun, ß-glukosidaz enzimi üzerine, pNPG substratı varlığında, sırasıyla yarışmalı ve yarışmasız tipte inhibisyon etkisi gösterdiği tespit edilmiştir. ß-glukosidaz enziminin D(+)glukoz ile IC50 ve Ki değerleri 4,95 mM ve 2,6x10-3±1,42x10-3 olarak; δ-glukonolakton inhibitörü ile 8,64 mM ve 3,9x10-7±2,0x10-8 olarak hesaplanmıştır.

The ß-glucosidase has been the focus of much research recently because of their important roles in a variety of fundamental biological processes ß-glucosidase enzyme was purified ammonium sulfate precipitation and sepharose-4B-L-tyrosine-1-napthylamine hydrophobic interaction chromatography from Trichoderma harzianum NRRL 13019. The ß-glucosidase was obtained from the strain of T. harzianum NRRL 13019 by using moistening with NaH2PO4 (pH 7.0), ground corn cob as medium. The optimum conditions for the production of the enzyme from T. harzianum NRRL 13019 by solid state fermentation were determined to be 25 ° C and seven days. The ß-glucosidase enzyme obtained from T. harzianum was purified with 29.10 fold, a yield of 18.02%. The number of subunits and purification has been checked with two different electrophoresis methods to be SDS-PAGE/NATIVE-PAGE of ß-glucosidase enzyme. The purified enzyme was migrated as a single band on NATİVE and SDS-PAGE. The enzyme was determined a monomeric structure of 110 kDa weight. Activity of ß-glucosidase enzyme was determined by using p-nitrophenyl-ß-D-glucopyranoside (pNPG) substrate. The optimum pH value and optimum temperature which ß-glucosidase has the highest activity was pH 4,0 and 65°C respectively. The Km and Vmax values of ß-glucosidase enzyme were determined as 0.334 mM and 3333.334 EU, respectively. Inhibition types of δ-gluconolactone and D(+)glucose were determined noncompetively and comeatively type on the ß-glucosidase enzyme, respectively in the presence of p-nitrophenyl substrate by using Lıneweaver-Burk Graphıcs. The IC50 and Ki values of δ-gluconalactone were determined as 8.64 mM and 3.9x10-7±2.0x10-8 where as for the D(+)glucose 4.95 mM and 2.6x10-3±1.42x10-3, respectively.