ADAMTS1 promotorunun SMAD aracılı regülasyonunun incelenmesi

Abstract

ADAMTS1 (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type I motif, 1), ADAMTS ailesinin ilk örneğidir ve Kuno ve arkadaşları tarafından fare ADAMTS1 geninin karakterizasyonu 1997 yılında yapılmıştır. ADAMTS1, endotel hücre çoğalması ve anjiogenezi TSP1 ve endostatin daha etkili bir şekilde engelleyen bir angiogenez inhibitörü olarak tanımlanmıştır. Farklı mekanizmalar ADAMTS1'in anti-anjiogenik işlevi için önerilmiştir. Hem anti-anjiyogenetik hem de agrekanaz aktiviteli ADAMTS1' in birçok patofizyolojik durumda regülasyonu bozulmaktadır. Ancak ADAMTS1 geninin transkripsiyonel regülasyonu ile ilgili sınırlı sayıda bilgi bulunmaktadır. Bu nedenle bu çalışmanın amacı Hep3B hücrelerinde ADAMTS1' in SMAD transkripsiyon faktörlerince regülasyonuna ışık tutmaktır. SMAD transkripsiyon faktörlerinin ADAMTS1 gen ekspresyonuna etkisi transkripsiyonel aktivitede ve mRNA seviyesinde belirlenmiştir. Öncelikli olarak SMAD2, SMAD3 ve SMAD4 transkripsiyon faktörlerinin Hep3B hücrelerinde ektopik ekspresyonu western blot ve real time teknikleri ile doğrulanmıştır. SMAD2 ve SMAD4' ün transfekte edildiği deney grubunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında ADAMTS1 24, 48 ve 72 saatlerde artış göstermiştir özellikle 24 saatte kontrol grubuna göre 5 kat artmıştır. SMAD3 ve SMAD4' ün transfekte edildiği deney grubunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında ADAMTS1 24, 48 ve 72 saatlerde artış göstermiştir özellikle 24 saatte kontrol grubuna göre 3,5 kat artmıştır. Transkripsiyonel aktiviteninin belirlenmesi için promotor parçalarının transfeksiyonunda ve ko-transfeksiyon analizlerinde kalsiyum-fosfat presipitasyon metodu kullanılmıştır. Bazal transkripsiyonel aktivite ve ko-transfeksiyonlardan elde edilen sonuçlar karşılaştırılmıştır. İnihisyon çalışmaları ile elde edilen değişikliğin kalkıp kalkmadığı da kontrol edilmiştir. Son olarak EMSA tekniği kullanılarak SMAD transkripsiyon faktörlerinin ADAMTS1 promotor bölgesine gerçekten bağlanıp bağlanmadığı da analiz edilmiştir. Yapilan analizler sonucunda SMAD transkripsiyon faktörlerinin gerçekten ADAMTS1 promotoruna bağlandığı EMSA ile teyit edilmiştir. ADAMTS1' in TGF-ß sitokinine olan cevabının SMAD aracı yoldan olduğu düşünülmektedir.

ADAMTS1 (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type I motif, 1) is the prototype of the ADAMTS family of proteins, and the term ADAMTS was first cloned and identificated by Kuno et al. in 1997. ADAMTS1 has been described as an angiogenesis inhibitor that blocks endothelial cell proliferation and angiogenesis more effectively than TSP1 and endostatin. Different mechanisms have been proposed to be responsible for the anti-angiogenic function of ADAMTS1. ADAMTS1 that has both anti-angiogenetic and aggrecanese activity was disregulated in many pathophysiologic circumstances. However, there is limited information available on transcriptional regulation of ADAMTS1 gene. Therefore, this study mainly aim to identify the regulation of ADAMTS1 gene by SMAD transcription factors in human hepatoma cells (HEP3B). Regulation of SMAD transcription factors on ADAMTS1 gene expression determined with transcriptional activity and mRNA level of ADAMTS1 gene. Firstly, ectopic expression of SMAD2, SMAD3 and SMAD4 transcription factors verified by western blot and Real time PCR in Hep3B cell line. After transfection of SMAD2 and SMAD4 expression vector into Hep3B cell line, we obtained 5 fold expression of ADAMTS-1 mRNA compraring control cells at 24h. We also obtained 3,5 fold expression of ADAMTS-1 mRNA after transfection of SMAD3 and SMAD4 expression vectors. For the transcriptional activity, calcium phosphate precipitation method used for transient transfection of promoter constructs and co-transfection analysis. Basal transcriptional activity and the data obtained from co-tansfection analysis compared. We also treated the cells spesific SMAD inhibitors and then analysed mRNA level and promoter activity of ADAMTS1. As a result of EMSA analysis we obtain interaction between SMAD transcription factor and ADAMTS1 promotor. It was thought that the response of ADAMTS-1 gene expression possibly through SMAD-dependent TGF-ß pathway.