Zeytin ß-glukozidaz enziminin saflaştırılması ve nano parçacıklara immobilizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, zeytin (Olea europaea L.) meyvesinden elde edilen β-glukozidaz enzimi iki aşamalı olarak saflaştırılmış ve nanoparçacıklara immobilize edilmiştir. Saflaştırma işleminde önce amonyum sülfat çöktürmesi devamında ise hidrofobik etkileşim kromatografisi yöntemleri kullanılmıştır. Çalışmamızda zeytin β-glukozidaz enzimi % 9,90 verimle 163,62 kat saflaştırılmıştır. Saflaştırılan zeytin β-glukozidaz enziminin SDS poliakrilamid jel elektroforezlerinde molekül ağırlığı 40 kDa olarak tek bant şeklinde görüntülenmiştir. Saflaştırılan zeytin β-glukozidaz enzimi karbodiimide ile aktifleştirilmiş süperparamanyetik Fe3O4 nanoparçacıklarına immobilize edilmiştir. Serbest enzimin optimum pH değeri 5,5 olarak belirlenirken, immobilize enzimin optimum pH değeri de 5,5 olarak bulunmuştur. Serbest enzimin optimum sıcaklığı 50 °C iken immobilizasyon işleminden sonra 5°C artarak 55°C'ye yükselmiştir. Serbest enzimin oleuropein substratına karşı optimum pH'sı 35°C olarak belirlenmiştir. Zeytin β-glukozidaz enziminin saf ve immobilize formlarının pNPG ve oleuropein substratlarına karşı KM ve Vmax değerleri Linewear-Burk grafiği ile belirlenmiştir. pNPG substratında saf enzim için 0,37 mM ve 370 EU/ml olarak immobilize enzim için 1,34 mM ve 384,61 EU/ml olarak belirlenmiştir. Oleuropein substratına karşı ise saf enzim için 1,7 mM ve 1000 EU/ml olarak immobilize enzim için 6 mM ve 2000 EU/ml olarak belirlenmiştir. Zeytin β-glukozidaz enziminin aktivitesine karşı inhibitör etkisi gösteren bazı kimyasallar, ağır metaller ve pestisitlerin IC50 değerleri hesaplanmıştır.

β-glucosidase enzyme is known to be localized to vacuoles in plant cells, as in many plants, the olive plant (Olea europaea L.) is the basis of the defense mechanism. In this study, β-glucosidase purified using hydrophobic interaction chromatography from olive with the specially designed Sepharose-4B-L-tyrosine-1-napthylamine. In purification process firstly the ammonium sulfate precipitation, secondly hydrophobic interactions chromatography methods were used. In our study, olive β-glucosidase enzyme, purified 163,62 fold with 9,90 % yields. The purified olive β-glucosidase enzyme, was observed SDS-polyacyrilamide gel electrophoresis a single band with 40 kDa. The purified olive β-glucosidase enzyme was immobilized on the superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles with carbodiimide. The optimum temperature for β-glucosidase was determined 35 ºC using pNPG. The optimum temperature for β-glucosidase (50 ºC) was increased by 5 °C after immobilisation, while the optimum pH and immobilisation pH for β-glucosidase was by 5,5. The KM and Vmax values were determined of free and immobilized enzyme by the method of Lineweaver-Burk plots, using pNPG and oleuropein as substrates.The KM and Vmax values of free and immobilized β-glucosidase were determined 0,37 mM (370 EU/ml) and 1,34 mM (334,61 EU/ml) by the method of Lineweaver-Burk plots for pNPG substrate. The KM and Vmax values of free and immobilized β-glucosidase were determined 1,7 mM (1000 EU/ml) and 6 mM (2000 EÜ/ml) by the method of Lineweaver-Burk plots for oleuropein substrate. Some chemicals showing an inhibitory effect against the activity of β - glucosidase olive was calculated IC50 values of the heavy metals and pesticides.