Aspergillus flavus karbonik anhidraz geninin klonlanması ve E. coli'de ekspresyonu

Abstract

Araştırmamızda Balıkesir ili ve çevresinde satışa sunulan çeşitli çavdar örnekleri küf florası bakımından incelenmiştir. İl çevresindeki çeşitli köy ve ilçelerden temin edilen 10 çavdar örneğinde bulunan Aspergillus flavus (A. flavus) fungal türünün izolasyonu ve tanılanması amaçlanmıştır. Toplam 601 küf izole edilmiş ve 22 adet mikotoksijenik etki yapan küf türleri arasında olan A. flavus türü tanımlanmıştır. Ayrıca, A. flavus beta Karbonik Anhidraz (CA) ailesinden olan A. flavus'a ait karbonik anhidraz geninin klonlanması ve rekombinat proteinin E.coli'de üretilmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda A. flavus'da RNA izolasyonunun ardından RT-PCR stratejisi ile A. flavus CA geni pGEM-T vektörüne klonlanmıştır. Klonlanan genin dizi analizi sonucu, cDNA ile % 99 oranında homoloji göstermiş, genin 94. pozisyonunda 189 bazlık ve 234. pozisyonunda 87 bazlık olmak üzere 2 adet insersiyon gözlenmş ve ayrıca delesyon, yer değiştime mutasyonları taşıdığı belirlenmiştir. Putatif gen ürününün ifade olup olmadığı belirlenmesi için gen pET30a(+) ekspresyon vektörüne alt klonlanmıştır. Protein ekspresyonu, E.coli'de optimize edilen koşullarda BL21(DE3) kodon plus hücrelerinde IPTG ile indüklenerek yapılmıştır. SDS PAGE analizi ve takiben Western Blot analizi ile protein ürününün ifade olmadığı belirlenmiştir. Genin taşımış olduğu insersiyon, delesyon ve yer değiştirme mutasyonları baz alındığında, olası yalancı gen (pseudogen) olduğu düşünülmektedir.

In this study variety of rye which is offered for sale in province of Balıkesir and surrounding area was examined in terms of mold flora. Isolation and identification of fungal Aspergillus flavus (A. flavus) species from ten different rye sample obtained from various villages and towns around the city was aimed.Totally 601 mold were isolated and 22 A. flavus species which have mycotoxigenic effect were identified. Further cloning of A. flavus carbonic anhydrase which belongs to ß- CA family and expression of recombinant protein in E.coli was also aimed. Therefor A. flavus CA gene was cloned into pGEM-T vector based on RT-PCR strategy after isolation of RNA from A. flavus. Sequence analysis revealed 99% homology with cDNA. Two insertion, deletion and substition mutations at the 94bp and 234bp positions with the size of 189bp and 87bp was determined. To determine whether the putative gene product expression it was subcloned into pET30a(+) expression vector. Protein expression was optimised in E.coli BL21(DE3) Codon plus cells induced with IPTG. SDS-PAGE analysis followed with Western-blot was revealed that a protein product wasn't expressed. It is thought to be a possible pseudogene from insertion, deletion and substition type of gene mutations.