Streptococcus mutans karbonik anhidrazının ekspresyonu, saflaştırılması, elektroforetik ve kinetik özelliklerinin araştırılması

Abstract

Diş çürüğü oluşumuna sebep olan oral patojenik bakteri Streptococcus mutans, ß-sınıfı karbonik anhidrazı (CA, EC 4.2.1.1), SmuCA, kodlar. Karbonik anhidrazlar tüm canlılar aleminde karbondioksitin bikarbonat ve protona hidrasyonu gibi basit ancak fizyolojik açıdan önemli olan bir reaksiyonu katalizler. Bu çalışmada bazı klasik ve klinik sülfonamidlerin SmuCA üzerine inhibisyon etkileri araştırıldı. SMU_328 geni S.mutans UA159 genomundan PCR'a dayalı teknik ile çoğaltıldı. SMU_328 geni pGEM-T Easy vektörüne ve ardından da pET30a ekspresyon vektörüne klonlandı. SmuCA' nın ekspresyonu E.coli BL21(DE3) içerisinde gerçekleştirildi. SmuCA, Ni-NTA afinite kolonu ile saflaştırıldı. Enzimin saflığı Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile tespit edildi. Enzim aktivitesi ve inhibisyon çalışmaları Stopped flow cihazı ile yapıldı. SmuCA üzerine 40 adet sülfonamidin inhibisyon etkisi araştırıldı. SmuCA kcat = 4.2 x 105 s-1 ve kcat/Km = 5.8 × 107 M-1 x s-1 ile CO2 hidrasyon reaksiyonu için iyi bir katalitik aktivite göstermiştir ve çoğu sülfonamidler ile etkili bir şekilde inhibe edilmiştir (Kı değerleri 246 nM – 13.5 µM). En etkili SmuCA inhibitörleri bromosulfanilamid, deasetile asetazolamid, 4-hidroksimetilbenzensülfonamid, pirimidin-yerdeğiştirilmiş sulfanilamid, aminobenzolamid ve yapıca benzeri olanlar ile birlikte asetazolamid, metazolamid, indisulam ve valdekoksib olarak belirlenmiştir. Bu bileşikler 246 ve 468 nM arasında değişen inhibisyon sabiti göstermişlerdir.

Streptococcus mutans, the oral pathogenic bacterium provoking dental caries formation, encodes for a ß-class carbonic anhydrase (CA, EC 4.2.1.1), SmuCA. Carbonic anhydrases catalyze a simple but physiologically important reaction in all life kingdoms, the hydration of carbon dioxide to bicarbonate and protons. In this study the inhibition effects of some classical and clinical sulfonamides on SmuCA were investigated. SMU_328 gene was amplified from S.mutans UA159 genom by PCR based strategy. SMU_328 gene was cloned into pGEM-T Easy vector and subsequently into pET30a expression vector. The exypression of SmuCA was performed in E.coli BL21(DE3). SmuCA was purified by Ni-NTA affinity column. The purity of enzyme was determined by Sodium Dodesyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Enzyme activity and inhibition studies were performed by Stopped Flow spectrophotometer. The inhibition effects of 40 sulfonamides on SmuCA were investigated. SmuCA has showed a good catalytic activity for the CO2 hydration reaction, with kcat 4.2 x 105 s-1 and kcat/Km of 5.8 × 107 M-1 x s-1, and was efficiently inhibited by most sulfonamides (KIs of 246 nM – 13.5 µM). The best SmuCA inhibitors were bromosulfanilamide, deacetylated acetazolamide, 4-hydroxymethylbenzenesulfonamide, a pyrimidine-substituted sulfanilamide, aminobenzolamide and compounds structurally similar to it, as well as acetazolamide, methazolamide, indisulam and valdecoxib. These compounds showed inhibition constants ranging between 246 and 468 nM.