Alkalen fosfataz enziminin saflaştırılması ve bazı ilaçlara karşı afinitesinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, fosfat metabolizmasında önemli role sahip olan Alkalen Fosfatazın (ALP), sütte pastörizasyon belirteci olarak kullanılması gerekçesiyle sütte bulunan izoformu biyokimyasal yöntemlerle saflaştırılmış ve bazı veteriner ilaçların enzim aktivitesi üzerine etkileri araştırılmıştır. Enzim, çeşitli organik çözücülerle muamele edilerek amonyum sülfat çöktürme aralıkları tespit edilmiştir. Sütü mayalama işlemi ile hazırlanan farklı enzim çözeltileri de dahil olmak üzere, Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılarak elde edilen enzim aktiviteleri ve saflaştırma dereceleri karşılaştırılmıştır. Sütün mayalanması ile elde edilen enzim çözeltileri SDS poliakrilamid jel elektroforezine uygulanarak yaklaşık 85 kDa ve 185-190 kDa molekül ağırlığına sahip bandlar elde edilirken doğal jel elektroforezinde yaklaşık 170-190 kDa aralığında tek band elde edilmiştir. Süt Alkalen Fosfatazın p-nitrofenil fosfat substratına karşı KM ve Vmax değerleri, Lineawear-Burk yöntemi ile sırasıyla 2,27 mM ve 555,56 EU/dk olarak bulunmuştur. Enzim, pastörizasyon sıcaklığına gelindiğinde inaktive olacağından enzim aktivitesinin gözlenmemesi sütün pastörize olduğunu gösterir. Fakat, veteriner ilaçlar tarafından enzimin inaktivasyonu söz konusu olduğunda, pastörizasyon sıcaklığına ulaşılmadan enzim inhibe olacağından doğru bir pastörizasyon gerçekleştirilemeyecektir. Bu sebeple çalışmamızda çoğunluğu antibakteriyel özelliğe sahip çeşitli veteriner ilaçların saflaştırılmış süt ALP enzim aktivitesi üzerine in vitro etkileri incelenmiş ve inhibisyon etkisi gösteren ilaçların IC50 değerleri hesaplanarak, ilaçlara ait sütte belirlenen maksimum kalıntı limitleriyle karşılaştırılmıştır. ALP'nin bilinen inhibitörü olan Levamisol ile karşılaştırıldığında, enzim aktivitesini azaltan ilaçların zayıf inhibitör etki gösterdiği belirlenmiştir.

In this study, Alkaline Phosphatase (ALP) which has a critical role in phosphate metabolism was purified via biochemical methods and the effects of some veterinary drugs on purified milk ALP were determined on account of the fact that using as a pasteurization indicator in milk. Enzyme was homogenized with different organic solvents thereby ammonium sulfate precipitation intervals were determined. The all enzyme samples with different yeasting products were applied to Sephadex G-100 gel filtration column and then the enzyme activities and purification folds obtained from different stages were compared. The different yeasting enzyme products yielded bands, approximately 85 and 185-190 kDa on SDS-PAGE, while yielded a single band, approximately 170-190 kDa on Native-PAGE. The KM and Vmax values were determined by using Lineweaver-Burk plots and p-nitrophenyl phosphate as substrate, 2.27 mM and 555.56 EU/min, respectively. Heat treatment of milk at pasteurization temperature inactivates ALP, which is a good indicator of milk pasteurization. But, in case of decreasing ALP activity by veterinary drugs, inactivation occurs and inaccurate pasteurization performs. Therefore, the in vitro effects of some veterinary drugs, that most of them have antibacterial property, on purified ALP enzyme activity were investigated. The IC50 values of drugs which have inhibitory effect were determined and compared with maximum residue limits in milk belonging to drugs. When compared to Levamisol which is a potent inhibitor of the enzyme, the inhibitory effects of the drugs on the enzyme activity are weak.