İnsan karbonik anhidraz III (CAIII) promotorunun klonlanması ve genin ekspresyon profilinin analizi

Abstract

İnsan Karbonik Anhidraz III geni (CAIII), karbonik anhidraz ailesinin diğer üyelerinden düşük CO2 hidrataz aktivitesi ve sülfanamid inhibitörlerine karşı direnç gösterme özellikleriyle ayrılır. 8.kromozomun q22 bölgesine lokalize olan CAIII geni kasa spesifiklik göstererek erkeklerde ve fetüslerde yüksek seviyelerde ifade olmaktadır. İnsan CAIII geninin farklı hücre serilerinde ekspresyon profili için semi qantitatif RT-PZR çalışmaları yapılmıştır. Bu amaçla Kolon Karsinom Hücre Hattı HT-29, Osteosarkom Hücre hatıı MG63 ve Saos-2, Karaciğer Kanser hücre hattı Hep3B, HUVEC, Meme Kanser hücre hattı MCF-7, Prostat Kanseri hücre hattı PC3 ve DU-145'ndan CAIII'ün ekspresyon seviyesine bakılmış ve sadece HT-29, MG63, Saos-2 ve HUVEC hücre hatlarında mRNA düzeyinde ekspre olduğu bulunmuştur. Sitokinlerin CAIII'ün ekspresyon seviyesinde etkisini belirlemek amaçlı seçilen sitokinler, TGF-ß, TNF-α, IL-1α, IL-6 ve IFN-γ, HT-29 hücre hattına uygulanmış ve zamana bağlı değişimi belirlemek için gerçek zamanlı qRT-PZR çalışmaları yapılmıştır. CAIII proteinin HT-29 hücre hattında protein düzeyinde ifadesi de western blot tekniği ile gösterilmiştir. CAIII'ün transkripsiyonel aktivitesinin belirlenmesi amaçlı, İnsan CAIII geninin promotor bölgesi -939/+86 bç'lik bölgeden genomik PZR yöntemiyle PGEMT-easy içine klonlanmıştır. Transkripsiyonel aktivitesinin belirlenmesi amaçlı lusiferaz haberci vektör içine alt klonlanmıştır. Ayrıca olası transkripsiyon faktörleri bağlanma bölgeleri biyoinformatik olarak analiz edilmiştir.

Human Carbonic Anhydrase III (CAIII), differs from other membres of the family of Ccarbonic anhydrase with lower CO2 hidratation activity and resistance to classical CA sulphonamides inhibitors. CAIII gene localized to the 8. Chromozome at q22 region is specifically high expressed in muscles in males and fetuses. The expression profile of human CAIII gene was carried out by semi quantitative RT-PCR analysis in different cell lines. The mRNA expression of CAIII was determined from HT-29 (Colon carcinoma cells), MG63 (Ostosarcoma cells), Saos-2 (Osteosarcoma cells), HUVEC (Endothelial cells) although there is no expression was detected in MCF7 (Breast carcinoma cells), PC3 (Prostate carcinoma cells), DU145 (Prostate carcinoma cells) and Hep3B (Hepatoma cells cell lines. In order to the determine the effect of cytokines on the CAIII expression, TGF-ß, TNF-α, IL-1α IL-6 and IFN-γ cytokines were chosen and applied to HT-29 cells. Then, Real-Time qRT-PCR were carried out so as to determine the selected cytokines on the time dependent chances at mRNA level of CAIII. In addition, the presence of CAIII protein was demonstrated by western blot analysis. In order to determine transcriptional activity of CAIII promoter, -936/+86bp CAIII promotor region was amplified by PCR based approached and cloned into pGEM-T easy vector. In addition, the putative transcription factor binding motifs were analysed bioinformatically in the CAII promoter.