Yönlendirilmiş mutagenez ile karbonik anhidraz 9 promotorunun fonksiyonel analizi

Abstract

Karbonik anhidrazlar hayvanlardan, fotosentetik canlılara kadar neredeyse tüm canlı hücrelerde bulunan metaloenzimlerdir. CA9 proteinin ekspresyonu tümör hücrelerinin pH düzenlenmesinde rol alarak hücrelerin mikroçevrelerine adaptasyonunu sağlar. Yüksek seviyedeki ekspresyonu ile katı tümörlerde biyobelirteç olarak kullanılmaktadır. Hipoksik koşullar tümör hücrelerinin metastatik ve anjiyogenesis özelliğini kazanmasında rol oynamaktadır. CA9 ve hipoksik koşulların ilişkisi ile ilgili çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Çalışmamızda hipoksik koşullarda CA9'un regülasyounda önemli olan ve genin promotorunda bulunan HRE bölgesi mutasyona uğratılmıştır. Transfeksiyon analizleri ile mutasyona uğratılan CA9 geninin regülasyonu özellikle hipoksik koşullarda incelenmiştir. Ayrıca tüm çalışmalar normal oksijen şartları altında da yapılmıştır. Normal oksijen seviyesinde ve hipoksik şartlarda HRE mutant olan CA9 promotorunun aktivitesinin düştüğü gözlemlenmiştir. Aynı zamanda çalışmamızın ikinci kısmında, TGF-ß sitokininin CA9 ekspresyon seviyesine etkileri hem hipoksik hem de normoksik koşullarda analiz edildi. Hem RNA hem de protein seviyesinde TGF-ß sitokini uygulanan gruplarda CA9 ekspresyonunun hipoksik şartlarda arttığı gözlemlendi. TGF-ß sitokinin etkisinin aydınlatılması ve sinyal yolağının belirlenmesi amacıyla da RNA ve protein seviyesinde yapılan analizler sonucunda MEK ve PI3K yolaklarının etkili olabileceği gösterildi.

Carbonic anhydrases is that in animals to photosynthetic organisms that in almost all cells in the metaloenzyme. CA9 the expression of the protein in tumor cells pH taking on a role in the regulation of cell microenvironment adaptation. This level of expression by taking advantage of solid tumors and are used as a biomarker. Hipoxic conditions of formation of metastatic tumor cells and anjiyogenesis to acquire a property plays an important role. CA9 and hypoxic conditions, the relationship is not perfectly in molecular terms. In this context, the study CA9's promoter located in the region of HRE, we have identified mutations and transgression. Transfection analysis is CA9 functional factor in both the normal level of oxygen and under the terms of hypoxic environment, to investigate the activity. Normal oxygen level, and hypoxic conditions mutant in which HRE CA9 promototer activity we have observed a decrease. At the same time, in the second part of our study, TGF-heterozygote cytokinin-CA9 the level of expression of the influence of hypoxic both normoksik conditions were analyzed. Both the RNA and the protein level of TGF-heterozygote sitokini applied to groups CA9 the expression of hypoxic conditions, the increase was observed. TGF-heterozygote cytokine effects and the elucidation of the signal pathway in order to determine the RNA and protein level in the result of the analysis of the MEK, and PI3K effective pathways can be shown.