ADAMTS-8 geninin SP1 aracılı transkripsiyonel regülasyonu

Abstract

ADAMTS'ler ekstraselüler matrikse salgılanarak matriksin yapısal proteinlerini parçalamaktadır ve özel trombospondin 1 motiflerini içermektedir. Metaloproteinaz olarak, ADAMTS-8, tümör büyümesi, büyüme faktörlerinin düzenlenmesi gibi invazyon ve metastaz süreçlerinde önemli rol oynamaktadır. Kolorektal kanser hücrelerinde ADAMTS-8 düşük ekspresyonunun, hücre proliferasyonunu engellediği, apoptozu tetiklediği ve HCT116, HT-29 modellerinde invazyon ve migrasyonu baskıladığı gözlemlenmiştir. SP1, memeli ve viral genleri düzenleyen, DNA bağlama bölgesini tanıyan proteindir. Aktif bölgesinde transkripsiyonu artırmaktan sorumlu üç çinko parmağı içeren SP1, GC-zengin DNA dizilerine bağlanmaktadır. SP1, KRK gelişimi ve ilerlemesinde önemli rol oynamaktadır. Çalışmada, kolorektal kanserde supresör gen olan ADAMTS-8'in, kolorektal kanserde düzenleyici SP1 ile regülasyonu incelenmiştir. Bu amaçla ADAMTS-8 geninin promotor bölgesinin transkripsiyonel aktivitesini belirlemek için beş farklı uzunluktaki promotor parçaları lusiferaz vektörüne klonlandı. SW480 hücrelerinde geçiçi transfeksiyon çalışmalarıyla bazal aktiviteler kıyaslandığında en yüksek aktiviteyi TS-8[-854/+323] promotor parçası gösterdi. Yapılan biyoinformatik analizlerle ADAMTS-8 geninin oldukça fazla SP1 bağlanma bölgesi içerdiği belirlendi. Ko-transfeksiyon çalışmalarıyla SP1'in ADAMTS-8 promotor aktivitesini özellikle TS-8[-854/+323] promotor parçasında azalttığı belirlendi. SP1'in promotora fonksiyonel olarak bağlanıp bağlanmadığını belirlemek amacıyla ChIP analizi gerçekleştirildi. ADAMTS-8(-353/-234), ADAMTS-8(-87/+38) ve ADAMTS-8(+188/+312) bölgelerine bağlanmanın gerçekleştiği doğrulandı. Sonrasında SW480 modelinde CEBP, USF ve SP1 over ekspresyonunun ADAMTS-8 protein seviyesine etkisi western blot ile belirlendi. SP1'in ADAMTS-8 protein ifadesini neredeyse yarıya düşürdüğü tespit edildi. SW480 ve yan model olarak seçilen SAOS-2 hücre hattında SP1 over ekspresyonunun ADAMTS-8 mRNA seviyesine etkisi qRT-PCR ile belirlendi. Hem SW480 hem SAOS-2 modelinde SP1 over ekspresyonunun ADAMTS-8 mRNA seviyesini azalttığı belirlendi.

ADAMTSs are secreted into the extracellular matrix and degrade structural proteins of the matrix and contain special thrombospondin 1 motifs. As a metalloproteinase, ADAMTS-8 plays an important role in invasion and metastasis processes such as tumour growth and regulation of growth factors. It has been observed that ADAMTS-8 low expression in colorectal cancer cells inhibits cell proliferation, induces apoptosis and suppresses invasion and migration in HCT116, HT-29 models. SP1 is a DNA binding site- recognising protein that regulates mammalian and viral genes. Containing three zinc fingers responsible for increasing transcription in its active site, SP1 binds to GC-rich DNA sequences. SP1 plays an important role in CRC development and progression. In this study, the regulation of ADAMTS-8, which is a suppressor gene in colorectal cancer, by the colorectal cancer regulator SP1 was investigated. For this purpose, promoter fragments of five different lengths were cloned into luciferase vector to determine the transcriptional activity of the promoter region of ADAMTS-8 gene. TS-8[-854/+323] promoter fragment showed the highest activity when basal activities were compared with transient transfection studies in SW480 cells. Bioinformatic analyses revealed that ADAMTS-8 gene contains many SP1 binding sites. Co-transfection studies revealed that SP1 decreased ADAMTS-8 promoter activity especially in TS-8[-854/+323] promoter fragment. ChIP analysis was performed to determine whether SP1 binds functionally to the promoter. Binding to ADAMTS-8(-353/-234), ADAMTS-8(-87/+38) and ADAMTS-8(+188/+312) regions was confirmed. Subsequently, the effect of CEBP, USF and SP1 overexpression on ADAMTS-8 protein level in SW480 model was determined by western blot. SP1 was found to reduce ADAMTS-8 protein expression by almost half. The effect of SP1 overexpression on ADAMTS-8 mRNA level in SW480 and SAOS-2 cell line selected as a side model was determined by qRT-PCR. It was determined that SP1 ovarian expression decreased ADAMTS-8 mRNA level in both SW480 and SAOS-2 model.