Kolon kanseri hücre hattında normoksi ve hipoksi koşullarında TGF-β sitokininin ADAMTS-5 gen ifadesine olan etkisinin belirlenmesi

Abstract

Kolorektal kanser (CRC), farklı genetik ve epigenetik değişikliklere sahip heterojen bir hastalıktır. CRC gelişimi, ilerlemesi ve nüksüne yol açan mekanizmalar karmaşıktır. Kolon kanseri ile ilişkili sinyal iletim yollarının moleküler mekanizmasının aydınlatılması ve tedavi edici ajanların geliştirilmesi hedeflenmektedir. TGF-β ailesi, tümör gelişimini kontrol eden büyük bir hücre dışı büyüme faktörü grubudur. Kolon karsinomunun farklı evrelerinde anormal TGF-β ekspresyonu gözlenmektedir. TGF-β sinyal yolu yeni tedaviler için ilginç bir hedef haline gelmiştir, bu nedenle TGF-β 'dan etkilenen genlerin tespiti ve bu genlerin ayrıntılı analizi çok önemlidir. ADAMTS (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs) genleri matriks bozulması, kan pıhtılaşması ve anjiyogenez dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonlara aracılık eden hücre dışı metaloproteinaz ailesidir. Çalışmamızda kolon kanserinde TGF-β sitokininin ve hipoksinin ADAMTS-5 gen ifadesi üzerindeki etkisi hem normal hem de hipoksik koşullarda araştırılmıştır. Çalışmamızda hipoksik ortamın oluşturulmasında CoCl2 ile indüklenmiş kimyasal hipoksik model tercih edilmiştir. Öncelikle kolon kanseri hücre hattı (HT-29) hücreleri %10 Fetal Buzağı Serumu ve 2 mM L-Glutamin eklenmiş DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) içinde kültürlenmiştir. Hücreler %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37°C'de kültürlenmiştir. Hücre canlılığı, tripan mavi boyaması ile belirlenmiştir. Çalışmamızda öncelikle hipoksik durumun ve sitokin muamelesinin hücreler üzerindeki etkisi MTT testi ile belirlenmiştir. Daha sonra TGF-β ve hipoksinin hem ayrı ayrı hem de birlikte ADAMTS-5 mRNA seviyesine etkisi Real Time PZR ile belirlenmiştir. 24 saatte 500U TGF-β uygulanan hücrelerde ADAMTS-5 mRNA ifadesinin baskılandığı tespit edilmiştir. Ayrıca etkinin protein seviyesinde tespiti için western blot çalışmaları yapılmıştır. 72 saat hipokside ise TGF-β uygulanan hücrelerde ADAMTS-5'in protein seviyesinde artış tespit edilmiştir.

Colorectal cancer (CRC) is a heterogeneous disease with distinct genetic and epigenetic alterations. The mechanisms leading to CRC development, progression and recurrence are complex. The main focus of colon cancer research has been the elucidation of the molecular mechanism of signal transduction pathways and the development of therapeutic drugs for these key molecules. The TGF-β family constitutes a large group of extracellular growth factors that control tumor development. Abnormal TGF-β expression was observed in colon carcinoma. The TGF-β pathway has become an interesting target for novel therapies, and detailed analysis of TGF-β affected genes are very important. ADAMTS (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs) genes are an extracellular family of metalloproteinases that mediate various functions, including matrix disruption, blood clotting, and angiogenesis. In our study, the effect of TGF-β cytokine and hypoxia on ADAMTS-5 gene expression in colon cancer was investigated. HT-29 cells were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) supplemented with 10 % heat inactivated FCS (Fetal Calf Serum) and 2 mM L-glutamin. The cultures were maintained at 37 ̊C in a humidified incubator containing 5% (v/v) CO2 in air. Firstly, the effect of hypoxia and cytokine treatment on cells was determined by the MTT test. ADAMTS-5 mRNA level was determined by Real Time PZR in both normoxic and hypoxic cytokine treated groups. 500U TGF-β decreased the ADAMTS-5 mRNA level in normoxia. We analyzed the protein expression level of ADAMTS-5 by western blot. We found that ADAMTS-5 protein level was incerased by TGF-β in hypoxia at 72h.